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| 質粒抽提常見問題和解決 |
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| 點擊次數：2861 更新時間：2011-04-11 |
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1.沒有提出質粒或者質粒收獲量很低
A菌種老化
建議：對于甘油保存的菌種，需要先進行活化，涂布或者劃線菌種，重新挑選單菌落進行液體培養，并對菌種進行初搖活化，按照1:500的比例進行菌種培養。二次培養時間不要超出16小時（或者OD600不超過3.0）。
B低拷貝質粒
建議：如果是由于低拷貝質粒引起的質粒收獲量低，可以采用兩倍的菌體量，并相應增加各種Buffer的用量。
C質粒丟失
建議：某些質粒在次繼代培養的過程中會出現丟失的想象，另外檢查篩選抗生素的濃度是否正確。
D裂解不充分
建議：如果采用超過推薦量的菌體進行質粒制備，會導致菌體裂解不充分。可適當減少菌體的用量或者相應增大各種Buffer的用量。并確保細菌混懸均勻。
EBuffer中有沉淀未溶解
建議：BufferB1和BufferN1，BufferC1在溫度較低時會出現沉淀，使用前請檢查是否有沉淀生成，如果有沉淀生成，請置于37℃溫育片刻，待溶液澄清后使用。
FDNAWashBuffer中未加入要求量的乙醇
建議：按照說明書要求加入要求量的無水乙醇，使用后旋緊瓶蓋，防止乙醇揮發。另外對于質粒中提，大提等，要求用70%乙醇洗滌，請確保乙醇的體積不小于70%。
G離心柱中乙醇殘留
建議：漂洗后，可適當延長離心時間，盡量去除殘留的乙醇。另外對于質粒中提，大提和朝大量提取，建議離心后，將柱子或大漏斗用吹風機冷風吹片刻（或置于65℃烘箱），以*去除殘留的乙醇，便于洗脫和后續實驗操作。
H洗脫液加入位置不正確
建議：洗脫液應加在膜*，已取得的洗脫效果。
I洗脫液pH值不正確
建議：將DNA從柱子上洗脫下來的zui適pH值在7.0-8.5之間，如果洗脫液的pH超出此范圍將會顯著影響洗脫效果，請使用試劑盒配套的ElutionBuffer（pH8.5，10mMTris-HCl）進行洗脫，如果用ddH2O進行洗脫，請確保pH在7.0-8.5之間。
J洗脫體積的選擇
建議：洗脫體積將會影響zui終的收獲量，洗脫體積越大，收獲量越高，但是濃度將會降低。請使用試劑盒推薦的洗脫體積進行洗脫，以保證的收獲量和濃度。如果需要高濃度的質粒，請減少洗脫體積。另外，如果想收獲高濃度高收獲量的質粒，請根據試劑盒要求進行二次洗脫，再用推薦的方法進行沉淀，濃縮質粒。
K洗脫時間的選擇
建議：加入洗脫Buffer后，室溫放置2-5分鐘，將有利于洗脫。
2.質粒純度不高
A蛋白質污染
建議：選擇推薦量的菌體，離心后小心吸取上清，如果上清液中混有懸浮物，可再次離心，以*去除蛋白。另外如果用ddH2O作為稀釋溶液,測定OD比值，比值可能較低，造成蛋白污染的假象，可用pH8.0的TEBuffer來稀釋。
BRNA污染
建議：檢查配送的RNaseA是否*加入到BufferA1中，加入RNaseA后，BufferA1/RNaseA應該存放在4℃，如果存放時間過長，或者沒有正確存放，RNaseA活力下降，請重新加入RNaseA。
C基因組DNA污染
建議：加入BufferB1后，輕輕顛倒混勻，避免劇烈震蕩渦旋，加入BufferB1的處理時間不要超過5分鐘。
D菌株為含內源核酸酶的宿主菌株
建議：請選用含內源核酸酶的宿主菌株質粒DNA提取試劑盒，或者轉化質粒到不含內源核酸酶宿主菌株中。
3.加樣時DNA飄出加樣孔外
原因：柱中殘留乙醇未除干凈。
建議：洗脫質粒DNA前確保無乙醇殘留在柱子上。可再離心或者抽真空。 |
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